复发难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤中非病毒基

　

PD1免疫检查点抑制和CAR-T细胞治疗无疑是近年来肿瘤免疫治疗中的两把利刃。年9月23日，预印本medRxiv上发表的一项研究成果，题为Developmentandclinicalevaluationofnon-viralgenomespecifictargetedCARTcellsinrelapsed/refractoryB-cellnon-Hodgkinlymphoma（复发/难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤中非病毒基因组特异性靶向CART细胞的开发和临床评估）；使用PD1敲除的非病毒定点整合CD19-CART细胞，使之同时具有免疫检查点抑制和肿瘤杀伤能力，对复发/难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗有显著效果。

文章摘要：

近年来，嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗在血液系统恶性肿瘤的治疗中显示出巨大的前景。然而，利用病毒制CAR-T细胞会带来一些问题。CRISPR/Cas9基因组编辑技术应用于破坏内源性基因构建新型CAR-T细胞。在这里，我们成功地开发了一种通过CRISPR/Cas9产生非病毒基因组特异性靶向CART细胞的二合一方法。通过靶向AAVS1安全港基因座的一个CAR，我们证明了这些CART细胞的行为与慢病毒常规产生的细胞相似。此外，PD1敲除的抗CD19CART细胞表现出卓越的根除具有高PD-L1表达的肿瘤细胞的能力。在针对复发/难治性（r/r）侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）的过继治疗中，我们观察到这些PD1基因敲除的CART细胞治疗的患者具有持久的反应而没有严重的不良事件和完全缓解（CR）细胞。总的来说，我们的结果证明了非病毒基因组特异性整合CART细胞的安全性和可行性，从而为使用这些新型CART细胞进行癌症治疗提供了新的潜在策略。

近年，CART细胞治疗快速发展并在治疗癌症中展现出巨大潜力。然而，有病毒参与的CART细胞产生引发了一些缺陷，包括增加肿瘤细胞插入突变的风险，对病毒来源的DNA的特异性响应趋向于阻碍CAR的表达，且病毒制造需要昂贵的代价。由此，一些策略如利用转座子系统和mRNA转导的方法被用于产生无需病毒的CART细胞。最近的研究表明CRISPR/Cas9技术可以应用于产生无病毒T细胞产品并更正点突变或将TCR元件插入特定位点，这促使我们进一步优化条件并构建了无病毒基因组的特异性靶向CART细胞。本文中，我们展示了AAVS1位点特异性插入CART细胞展现出与传统CART细胞同样的功能。此外，临床前实验中PD1整合的抗CD19CART细胞展现出空前的清除肿瘤细胞的能力。更重要的是，已经开启的临床试验进一步表明PD1敲入的CART细胞在治疗复发/难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤病人的安全性和有效性。因此，我们通过使用非病毒基因组特异性靶向的CART细胞，为癌症治疗提供了一种新的有效CART细胞疗法。

首先，以荧光蛋白为靶标优化产生非病毒基因组特异性整合T细胞的方法。基于最适方法，选择AAVS1安全港用于CAR靶点，该靶点排除了功能性内源基因的影响，并评估该方法是否可以影响CART细胞的性质。构建了抗CD19CAR序列，由4-1BB和CD3ζ（命名为19bbz）的胞内域所组成。电穿孔七天后19bbz整合于AAVS1的效率约为10%（到19.8%）（图1a，b）。通过CRISPR编辑（ICE）分析推断，在五个代表性供体细胞中的indel百分比范围为67％-87％（图1c）。且整合在BulkCD3+、CD4+和CD8+T细胞中无偏好性（图1d）。为理解制剂本身的影响，我们彻底的比较了AAVS1整合的抗CD19CART细胞（命名为AAVS1-19bbz）与慢病毒产品抗CD19CART细胞（命名为LV-19bbz）。即使电穿孔导致了一定程度的细胞损伤，经彻底恢复后，最终产物依然具有较高的细胞活力（图1e）。有趣的是，我们发现电穿孔操作对比慢病毒感染赋予了CD8+T细胞更大的生长优势并超过了CD4+T细胞（图1f）。并发现AAVS1-19bbz和LV-19bbz细胞在肿瘤细胞刺激后都展现出类似的细胞膨大（图1g，h）。我们的方法并没有改变T细胞子集的分化（图1i）。

AAVS1位点（又称为PPP1R2C位点）位于人类基因组第19号染色体，是一个经过验证、能确保转入DNA片段预期功能的“安全港”位点。该位点是一个开放的染色体结构，能保证转入基因能被正常转录。另外很重要的一点是在该位点插入外源目的片段对细胞无已知的副作用。

相对于未处理T细胞，AAVS1-19bbz细胞和LV-19bbz细胞一样很好的响应肿瘤细胞，但伴随着少量的细胞标志表达和细胞因子分泌（图2a，b）。重要的是，像LV-19bbz细胞一样，AAVS1-19bbz细胞有效的清除了体内体外的肿瘤细胞（图2c-f）。综上，这些结果表明产生非病毒基因组靶向的CART细胞是可行的。

通过抑制剂或基因编辑阻断PD1/PD-L1通路被报道可以促进CART细胞的抗肿瘤活性。由此，我们发明了非病毒PD1靶向的抗CART细胞（命名为PD1-19bbz）。PD1-19bbz的CAR表达可被检测到约19%（到30.3%）供体T细胞（图3a，b）。高indel百分比（83%-93%）在来自于五个代表性供体总T细胞中被观察到（图3c）。PD1-19bbz细胞中的PD1基因的敲除通过在CAR+细胞与肿瘤细胞共培养后低的PD1蛋白表达被证明（图3d）。值得注意的是在反复的表达PD-L1的Raji细胞的刺激后，PD1-19bbz细胞的膨胀超过了LV-19bbz细胞（图3e）。像其他报道一样，PD1破坏不影响激活标志物的升高和细胞因子分泌以抵消靶细胞（图3f，g）。值得注意的是，相对于LV-19bbz细胞，PD1-19bbz细胞展现出在体内和体外更强的清除PDL1上调的肿瘤细胞的能力（图3h，i）。综上，我们认为我们的非病毒PD1整合的抗CD19CART细胞可以高效的发挥功能。基于临床前实验数据，继续开展临床试验并评估非病毒PD1整合的19bbz细胞在治疗复发/难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤中的安全性和可行性(ClinicalTrials.govNCT)。病人T细胞由新鲜外周血单核细胞（PBMCs）通过利用抗CD8/CD4微珠磁性分选而富集。在CD3/CD28激动剂刺激后，PD1-19bbz细胞通过非病毒介导的电穿孔重组spCas9蛋白、PD1特异性sgRNA和DNA模版而制造。CAR整合的平均百分比约20%且最高百分比达到47.3%。终产品的细胞活力和indel百分比分别超过90%和50%。所有病人都给予了环磷酰胺和氟达拉滨进行的淋巴去除化疗，并随后给予了一次一个剂量为0.5x-2x/kg体重的PD1-19bbz细胞的注射。试验执行后没有CART细胞相关高等级（≥3）的不良反应（AEs）。观察到轻微的细胞因子释放综合征（CRS）（等级1）且没有神经毒性发生。在两个代表性病人中，膨大的持久的CART细胞显示出相似的改变倾向（图4a，b）。如正电子发射断层扫描-计算机断层扫描（PET-CT）扫描所示，CR已实现，并且在上次随访时（90天）一直在进行（图4c，d）。综上，这些数据表明非病毒基因组特异性整合CART细胞在临床治疗中的安全性和可行性。预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇

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